WYKRYWANIE DOPINGU

Precyzyjne wykrywanie oraz identyfikacja niedozwolonych srodkow dopingujacych w organizmie sportowcow, uczestniczacych w zawodach (a takze wyrywkowo, w trakcie kontroli poza zawodami), jest zasadniczym elementem wspolczesnego systemu przeciwdzialania dopingowi w sporcie. Wynika to z przyjetej obecnie definicji dopingu, wedlug ktorej podstawowym kryterium diagnostycznym i dowodowym stosowania niedozwolonych srodkow jest stwierdzenie w moczu sportowca okreslonego zwiazku lub jego metabolitu, bądź tez przekroczenie dopuszczalnego progu (limitu) jego stezenia. Obecnie w laboratoriach antydopingowych, poza analizami moczu, przeprowadzane są rowniez badania probek krwi i innych materialow badawczych (np. wlosow).
Stad tez wynikaja wysokie wymagania stawiane badaniom, prowadzonym w laboratoriach antydopingowych, oraz dazenie do stałego udoskonalania metod wykrywania oraz identyfikacji zakaza-nych zwiazkow.
Wysilki zmierzajace w tym kierunku przyniosly, w ciagu ostatnich lat, szereg nowych rozwiazan w dziedzinie techniki instrumentalnej i analitycznej. Dzieki temu znacznie rozszerzyly się możliwości badan analitycznych, a uzyskane wyniki staly się wiarygodne. Warto, chocby pobieznie, zapoznac się z aparatura, badawcza nowej generacji, stanowiaca. zasadnicze wyposazenie czolowych laboratoriow antydopingowych. Sposrod nowych rozwiązan i innowacji technicznych pragne ukazac trzy rodzaje aparatow, ktorych zastosowanie okazalo się wyjatkowo korzystne.
Jednym z trudniejszych problemow, ktore nalezalo rozwiazac w toku badan antydopingowych bylo rozroznienie endogennych androgenow, takich jak testosteron, dihydrotestosteron (DHT) i dehydro-epianarosteron (DHEA), od ich syntetycznych pochodnych, stosowanych w celach dopingowych. Na podstawie wynikow rutynowych analiz antydopingowych nie mozna bylo rozstrzygnac, czy związki, ujawnione w moczu badanego sportowca, byly pochodzenia egzogennego, czy tez zostaly wytworzone w sposob naturalny w jego organizmie. Odroznienie androgenow egzogennych (syntetycznych) od wytwarzanych endogennie stalo sie. mozliwe dziejci wprowadzeniu nowej generacji aparatow .
GC/C/IRMS - nowa metoda bezposredniego wykrywania syntetycznego testosteronu
i endogennych androgenow
Udowodnienie przyjmowania preparatow testosteronu, w celu zwiejcszenia osiagniec, stalo sie. zasadniczym problemem z chwila zaliczenia testosteronu przez Komisje. Medyczna MK0L do srodkow dopingowych (1982 rok, po Igrzyskach Olimpijskich w Moskwie).
Przyjecie w 1983 roku przez Manfreda Donikego (profesora w Deutschen Sporthochschule w Kolonii), podwyzszonej wartosci wskaznika T/Et w analizach GC/MS za kryterium przyjmowania testosteronu w celach dopingowych bylo pierwszym krokiem w kierunku rozwiazania tego problemu. Chociaz badania populacji sportowcow ujawnily, ze srednie wartosci tego wskaznika wynosza l,0±0,9, to jednak, aby uniknac falszywie dodatnich wynikow testu, Komisja Medyczna MK0L przyjeła za dopuszczalna wartosc T/Et = 6, a zatem wszystkie wyniki ponizej tej wartosci uznawane sa za negatywne. Pozniejsze badania wykazaly, ze przyjecie powyzszych zalozen nie eliminuje trudnosci interpretacyjnych. Okazalo się np., ze podanie 250 mg testosteronu osmiu chinskim sportowcom spowodowalo podwyzszenie wskaznika T/Et tylko u trzech z nich, utrzymywujace się przez 1 dzien . Reagowali oni wiec odmiennie niz sportowcy rasy bialej (kaukaskiej). Na tej podstawie wnioskowano, ze u sportowcow pochodzenia azjatyckiego moga. wystepowac wyniki falszywie ujemne.
Skutecznym sposobem obnizania T/Et ponizej dopuszczalnej wartosci okazalo się jednoczesne przyjmowanie epitestosteronu z preparatami testosteronu. Tak wiec istniala rowniez mozliwosc falszowania wynikow tego badania.
Z drugiej strony, wartosci wskaznika T/Et powyzej 6, majace wskazywac na przyjmowanie egzogennego testosteronu, moga. byc efektem naturalnego zmniejszenia wydalania epitestosteronu. Z tego wzgledu Komisja Medyczna MK0L dopuszczalna , graniczna wartosc tego wskaznika podniosla do 10, zas wyniki pomiedzy 6 a 10 podlegaly weryfikacji poprzez dalsze badania (endo-krynologiczne).
Okazalo się ponadto, ze na wzrost T/Et moga wplywac rowniez takie czynniki, jak: spozycie alkoholu (zwlaszcza u kobiet), nieodpowiednie przechowywanie probek i rozwoj pewnych szczepow flory bakteryjnej w moczu , a wiec czynniki zupelnie nie zwiazane z przyjmowaniem syntetycznych preparatow testosteronu. Wszystko to sprawilo, ze udowodnienie przyjmowania testosteronu w celach dopingowych, nawet przy wysokich wartosciach wskaznika T/Et, stalo sie. problematyczne (odszkodowawcze procesy cywilne z reguiy konczyly się wygrana sportowcow, oskarzonych o doping).
Żeby przelamac ten impas, nasilily się poszukiwania metod bardziej skutecznych. Takim rozwiazaniem okazala się nowa metoda, wykorzystujaca urzadzenie, nazywane w skrocie GC/C/IRMS. Sklada się ono z chromatografu gazowego (gas chromatography - GC) sprzęzonego z komora spalania (combustion - C) oraz spektrometrem masowym (mass spectrometry - MS) i umozliwia bezposrednie wykrywanie syntetycznych androgennych hormonow w analizowanych probkach moczu sportowcow. Badanie oparte jest na tym, ze syntetyczny testosteron zawiera mniejsza ilosc izotopu wegla 13C niz hormon naturalny, powstajacy w organizmie. Okreslenie stosunku izotopow wegla 13C/12C, pochodzacego z testosteronu wyizolowanego z badanej probki moczu, pozwala ustalic, czy jest to hormon naturalny, czy tez syntetyczny.
W komorze spalania w wysokiej temperaturze (+850°C) dochodzi do spalenia wyizolowanego zwiazku (np. testosteronu) do podstawowych skladnikow H2O i CO2. Wegiel powstaly z CO2 jest nastepnie analizowany w spektrometrze masowym, wyposazonym w detektor izotopowy, ktory pozwala na oznaczenie stosunku izotopow wegla 13C/12C (Isotope Ratio Mass Spectrometry - IRMS).
W pierwszym etapie analizy w chromatografie gazowym nastepuje rozdział badanego materialu i wyizolowanie, w okreslonym czasie retencji, piku testosteronu lub innych interesujacych nas zwiazkow endogennych androgenow, (ktore nastepnie podlegaja spaleniu w komorze spalania do H2O i CO2).
W detektorze IRMS okresla się stosunek 13C/12C w promilach, oznaczany symbolem [513C (%o)] wobec wzorcowego gazu o standaryzowanym stosunku 13C/12C. Analiza ta wymaga dokladnego oczyszczenia izolowanego piku testosteronu, ktorego stezenie powinno wynosic okolo 50 ng. Procedura badawcza wymaga wiec wstepnego zageszczenia probki moczu i izolowania testosteronu na kolumnach chromatografu cieczowego wysokocisnieniowego (HPLC).
Jak ustalono w drodze badan eksperymentalnych, podanie 1 tabletki 40 mg preparatu testosteronu (Andriol) powodowalo wzrost T/Et powyzej 6, który utrzymywal sie. do 2 godzin, zas wynik 13C/12C, wskazujacy na przyjcie egzogennego testosteronu, utrzymywal się do 10 godzin (mimo powrotu wskaznika T/Et do wartosci prawidlowej). Badanie tą metoda pozwala na wykrycie stosowania egzogennego testosteronu nawet u osob z wrodzonym niskim poziomem wskaznika T/Et (np. u Azjatow). Natomiast podwyzszenie wskaznika T/Et do wartosci 14,7 nie zawsze znajdowalo potwierdzenie w analizach GC/C/IRMS, ktore dawaly wynik calkowicie negatywny .
Oznaczanie wskaznika T/Et nalezy wiec uznac za badanie wstepne . W przypadku przekroczenia wartosci 6,0 Komisja Antydopingowa moze rozszerzyc badanie probki B o wykonanie dodatkowego testu, określającego stosunek izotopow wegla 13C/12C (IRMS). Wynik ten bedzie podstawa ostatecznej oceny badania antydopingowego. Badanie to zastepuje uprzednio wykonywany w tych przypadkach test ketokonazolowy. Pozwala takze rozstrzygnać, czy wysoki poziom epitestosteronu, stosowanego w celu maskowania przyjmowania testosteronu i utrzymujacy wartosc wskaznika T/Et w granicach prawidlowych, jest pochodzenia egzogennego, czy tez jest naturalnie wytwarzany w organizmie sportowca.
Wysoka cena aparatu GC/C/IRMS (okolo 200 000 dolarow amerykanskich) oraz pracochlonna procedura przygotowania probki i przeprowadzenia analizy nie pozwalaja na zastosowanie tej metody do rutynowych analiz. Wyniki oznaczen, uzyskiwane przy uzyciu tej metody, stanowia_ wazny dowod w procesach sajlowych, w toku ktorych dochodzi do częstego podwazania materialu dowodowego.
W obowiązujacym w latach 2001-2002 wykazie zakazanych farmakologicznych klas srodkow i metod dopingu, podanym w Aktualnym Dodatku A Kodu Antydopingowego MK0L z 1 wrzesnia 2001 roku, zmieszczono nastepujaca uwage " W celu podjqcia ostatecznych decyzji, w przypadkach podejrzenia stosowania testosteronu, lub innych endogennych androgenow, nalezy brać pod uwagq zarowno wyniki zaburzen profilu steroidowego w moczu, jak i pomiar stosunku izotopow".


Chromatograf gazowy sprzęzony z detektorem wysokiej rozdzielczosci GC/HRMS

W analizach antydopingowych bardzo istotnym elementem diagnostycznym, decydujacym o mozliwosciach wykrywania zakazanych srodkow w badanych probkach moczu sportowcow, jest wysoka czulosc analityczna instrumentow badawczych, czyli zdolnosc do wykrycia najmniejszej ilosci danego zwiazku. Dotyczy to zwlaszcza wykrywania metabolitow steroidow anaboliczno-androgennych. Przerwa w przyjmowaniu tych srodkow na dlugo przed spodziewana, kontrola antydopingowa przeprowadzana np. w czasie zawodow lub podczas zgrupowan treningowych, sprawia, ze stezenia tych metabolitow moga. być bardzo niewielkie, a ich wykrycie zwyklymi metodami wrecz niemozliwe. Wprowadzenie do analiz antydopingowych aparatu o nazwie GC/HRMS (chromatograf gazowy sprzęzony z detektorem mas o wysokiej rozdzielczosci) pozwolilo na wykrywanie sladowych ilosci metabolitow steroidow anabolicznych, nawet po dluzszej niz miesiac przerwie w przyjmowaniu tych preparatow. Dotyczy to zwlaszcza zwiazkow anabolicznych, takich jak metandienon, stanozolol, metylotestosteron i clenbuterol, ktorych metabolity dlugo utrzymuja sie. w organizmie.
Od czasu wprowadzenia Spektrometrii Mas Wysokiej Rozdzielczosci GC/HRMS do laboratorium antydopingowego w Kolonii w 1995 roku na 116 pozytywnych probek az 75 zidentyfikowano za pomocą tego aparatu. Sposrod 28 probek, w ktorych stwierdzano obecnosc metabolitow metandienonu, tylko w 7 przypadkach wykryto go tradycyjna, metoda GC/MS, zas pozostale potwierdzono wylacznie metoda HRMS. W badaniach, przeprowadzonych przez Federacje. Podnoszenia Cięzarow przed Igrzyskami Olimpijskimi w Atlancie w 1996 r. w ponad 40 probkach, stwierdzono, rowniez za pomoca tej metody, obecnosc metabolitow steroidow anabolicznych .
Wysoka czulosc i specyficznosc analiz przy bardzo dobrej powtarzalnosci sprawily, ze aparat HRMS stal się urzadzeniem niezbednym do potwierdzania obecnosci (zwlaszcza sladowych ilosci) metabolitow steroidow anabolicznych we wszystkich podejrzanych probkach. Bardzo wysoka cena tego aparatu (okolo 500 000 dolarow) spowodowala poszukiwanie alternatywnych rozwiazan technicznych. W wyniku tych poszukiwan zostal skonstruowany chromatograf gazowy, sprzęzony ze spektrometrem MS/MS, pozwalajacy na wielokrotna analize glownych jonow widma poszczegolnego metabolitu i znacznie zwiekszajacy mozliwosci ich wykrywania. Pozwala on na potwierdzenie obecnosci sladowych ilosci metabolitow steroidow anabolicznych, wykrytych w tradycyjnym aparacie GC/MS.
Zaklad Badan Antydopingowych w Instytucie Sportu w Warszawie posiada tego typu aparat o nazwie GCQ Plus, firmy ThermoQuest-Finigan, ktory spelnia wymogi, stawiane wyposazeniu laboratoriow antydopingowych, ubiegajacych się o akredytacje MK0L. Aparat ten, poza zwykla analiza GC/MS, pozwala rowniez na rozbicie wyizolowanego jonu, tzw. jonu prekursora danego związku, na jony potomne, czyli tzw. corki, ktore sa charakterystyczne dla tego zwiazku. Pozwala rowniez na wykrywanie sladowych steżen metabolitow steroidow anabolicznych rzedu 1 ng lub ponizej w 1 ml moczu . Wykrywanie metabolitow 5 srodkow anabolicznych o stezeniach 0,2 ng/ml stalo sie. niezbednym warunkiem uzyskania akredytacji MK0L przez laboratoria antydopingowe. Sa_ to: clenbuterol oraz metabolity: nandrolonu, metylotestosteronu, metandienonu i stanazololu.
Obnizenie progu detekcji metabolitow nandrolonu wykazalo, ze moga one w nieznacznej ilosci wystepowac w moczu sportowcow w warunkach fizjologicznych, zwlaszcza po wysilkach . Przepisy Antydopingowe wprowadzily progi (limity) dopuszczalnych stęzen nor-androsteronu, ktore dla kobiet wynosza_ 5 ng/ml, zas dla mezczyzn -2 ng/ml moczu.
Warto wspomniec, ze w badaniach antydopingowych, przeprowadzonych w Zakladzie Badan Antydopingowych Instytutu Sportu w 2001 r., stwierdzono, ze w 15 probkach stezenie nor-androsteronu wynosilo powyzej 2 ng/ml i wahalo się od 2,5 do 350 ng/ml, natomiast w innych 19 stezenie tego metabolitu bylo ponizej dopuszczalnej granicy, czyli 2 ng/ml. Tylko 2 probki moczu zostaly pobrane poza zawodami. Wyniki te potwierdzaja uprzednie obserwacje, ze wysilek fizyczny moze miec wplyw na wydalana w moczu ilosc tego metabolitu .


Chromatograf cieczowy sprzęzony z detektorem masowym lub MS" (LC/MS lub LC/MS").


Trzecia. Nowością jaka pojawila sie niedawno w laboratoriach antydopingowych, jest chromatograf cieczowy, sprzezony z detektorem masowym lub MS (LC/MS lub LC/MS).
Jak zaznaczylismy wczesniej, wysoka powtarzalnosc i dokladnosc analiz stanowia o jakosci badan antydopingowych. Polączenie spektrometrii masowej z odpowiednia procedure chromatograficzna jest metoda z wyboru, charakteryzujaca się wysoka czułością , powtarzalnoscia i specyficznoscia oraz mozli-woscia. oceny ilosciowej badanych zwiazkow. O ile chromatograf gazowy sprzezony z spektrometrem mas (GC/MS) jest tzw. ,,zlotym standardem" w analizach lotnych substancji, to do pomiarow nielotnych zwiazkow wymagana jest analiza w chromatografie cieczowym (HPLC)
To nowe rozwiazanie techniczne jest polaczeniem - przez system API (Atmospheric Pressure Ionization) lub Electro Spray - starej, wyprobowanej metody chromatografii cieczowej wyso-kocisnieniowej (HPLC) z nowoczesnym detektorem MS (z mozliwoscia wielokrotnej analizy MS). Pozwolilo to ogromnie zwiekszyc zakres detekcji zwiazkow
o ciezarach masy molekularnej powyżej 1000, a nawet do 100 000 (GC/MS może wykrywac tylko do 1000) . Szereg analitycznych parametrow wykrywania zakazanych zwiazkow (czulosc, powtarzalnosc, oznaczanie ilosciowe oraz latwosc obslugi aparatu) sprawia, ze urzadzenie to nalezy do zasadniczego wyposazenia nowoczesnych laboratoriow antydopingowych. Analiza probek krwi
aparatem LC/MS pozwala na wykrycie estrow testosteronu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Analiza LC/MS/MS okazala sie. takze bardzo dobrą metodą oznaczania B-blokerow w moczu
Zgodnie z obecnymi przepisami antydopingowymi dopuszczalne stezenia salbutamolu (dozwolonego jedynie w inhalacjach) wynosza : 100 ng/ml w probkach moczu, pobranych od sportowcow w czasie zawodow i 1000 ng/ml w kontroli poza zawodami. Ilosciowe oznaczenia salbutamolu w moczu sportowcow, wykonane w LC/MS, daje znacznie lepsza powtarzalnosc
i prostolinijnosc pomiarow.
Postep techniczny, jaki dokonal sie. w analityce chemicznej w ciagu ostatnich dziesieciu lat, sprawil, ze wykrywanie oraz identyfikacja substancji chemicznych i farmakologicznych uznanych za dopingowe, przestalo praktycznie być problemem.. Przed laboratoriami antydopingowymi staje obecnie nowe wyzwanie wykrywanie dopingu hormonami peptydowymi, wsrod nich przede wszystkim erytropoetyny (EPO) i hormonu wzrostu (hGH). Hormony peptydowe, takie jak rekombinowana egzogenna erytropoetyna (rHuEPO) i rekombinowany hormon wzrostu (rhGH), znalazly sie. na liscie srodkow zakazanych przez MK0L juz w 1989 roku (klasa E), ale dotad nie bylo testow, ktore pozwalaly na udowodnienie stosowania ich w celach dopingu przez sportowcow. Powodem brak wiarygodnych metod wykrywania oraz identyfikacji syntetycznych hormonow rHuEPO i rhGH. Ostatnio pojawily się doniesienia o nowej formie EPO (wykazuje znacznie dluzsze i silniejsze dzialanie) o nazwie Novel Erythropoiesis Stimulating Protein (NESP). Synteza nowej formy erytropoetyny pobudza erytropoeze, w szpiku w identyczny sposob, jak naturalnie wytwarzane EPO lub rHuEPO. Modyfikacja czasteczki EPO, przez dodanie dwoch lancuchow sialowych, (z jednoczesna zamiana 5 aminokwasow na czasteczki weglowodanow) powoduje 3,5-krotne wydluzenie czasu jej poltrwania w organizmie. Pozwala to na ograniczenie podawania tego hormonu w leczeniu pacjentow z niedokrwistością..
Stosowanie rHuEPO lub nowej formy tego hormonu NESP stalo sie atrakcyjnym i skutecznym sposobem zwiekszenia zdolnosci organizmu sportowcow do jeszcze wyzszych osiagniec (wzrost transportu tlenu do miesni), zwlaszcza w dyscyplinach wytrzymalosciowych.
Metody wykrywania rekombinowanej egzogennej formy rHuEPO, zaproponowane w programie EPO Sydney 2000, beda stosowane podczas kontroli antydopingowej w czasie najblizszych Zimowych Igrzysk Olimpijskich w Salt Lake City.

Badania te opieraja się na dwoch rodzajach testow:

1) bezposrednich, roznicujacych struktury obu hormonow w probkach moczu na podstawie ich niejednorodności.

2) posrednich, czyli oznaczaniu tzw.markerow osocza krwi, ktorych zmiany sa^efektem dzialania hormonu .Metody bezposrednie polegaja na analizie zachowan obu postaci hormonow w rozdziale elektroforetycznym; w polu elektrycznym poruszaja sie. one z rozna szybkoscia. Porownanie ukladu (okolo 10 pasm widm) izoform naturalnego hormonu EPO (bardziej kwasne) z izoformami rHuEPO (bardziej zasadowe) pozwala na odroznienie rekombinowanej rHuEPO od naturalnej EPO. Uzyskane wyniki badan probek moczu lub surowicy porownuje się z rownoczesnie przeprowadzonymi analizami ukladu izoform: czystej naturalnej erytropoetyny, preparatow rekombinowanej rHuEPO oraz probek kontrolnych.
Przydatnosc tej metody jako kryterium dowodowego stosowania dopingu erytropoetyna potwierdzaja retrospektywne badania uczestnikow kolarskiego Wyscigu Dookola Francji w 1998 roku. U 14 sposrod 102 zawodnikow stwierdzono podwyzszenie poziomu EPO we krwi. W analizach elektrofore-tycznych 14 probek moczu, pobranych od tych samych zawodnikow, stwierdzono uklad izoform typowy dla rekombinowanej rHuEPO .
Pozniejsze badania potwierdzily uzytecznosc tej metody w roznicowaniu syntetycznej i naturalnej erytropoetyny w moczu. Krotki czas poltrwania erytropoetyny powoduje, ze juz po 48-72 godzinach nie stwierdza sie sladu rHuEPO w moczu.
Dlatego tez przeprowadza sie oznaczanie tzw. markerow osocza krwi, ktore wskazuja dluzsze utrzymywanie sie efektow dzialania przyjetego hormonu. Do markerow tych zalicza się oznaczenia przeprowadzane we krwi, jak: poziom hematokrytu, retikulocytow, % makrocytow (duzych erytrocytow) oraz w surowicy: poziomy rozpuszczalnego receptora transferyny (sTFR), ferrytyny oraz erytropoetyny. Uwaza się, ze ta grupa markerow odznacza się swoistoscia i specyficznoscia. diagnostyczna, pozwalajaca wyroznic osoby przyjmujace rHuEPO. Ponadto opracowano specjalne modele diagnostyczne wynikow tych oznaczen, potwierdzajacych stosowanie rHuEPO (ON-MODEL) i zestaw wynikow, wy kluczajacych przyjmowanie tego hormonu (OFF-MODEL).
W ramach programu wspolpracy MK0L i rzadu australijskiego dokonano analizy wiarygodnosci (walidacji) testow posrednich oraz okreslenia prawidlowych wartosci tych markerow w grupie osob, uprawiajacych sporty rekreacyjne, pochodzacych z roznych krajow europejskich, azjatyckich oraz z Australii. Analizowano wpiyw plci, wieku oraz zmiennosc osobnicza, i wynikajaca z stosowania roznych metod oznaczen. Wyniki analiz probek krwi i moczu wielokrotnie pobieranych w 1100 osobowej grupie ochotnikow, pochodzacych z 12 krajow, pozwoliły na ocene wiarygodnosci tych testow. Badania potwierdzily, ze stosowanie rHuEPO powoduje okreslone i powtarzalne zmiany hematologiczne jednakowe u sportowcow, pochodzacych z roznych kontynentow. Badania oznaczania poziomow tych markerow sa stosunkowo proste i wykonuje sie. je metodami enzymoimmunologicznymi w aparatach hematologicznych (m. in. ADIVA 120 Hematological Analyser firmy BAYER).
Zwraca się jednak uwage, ze stosowanie preparatu rHuEPO wraz z dozylnymi wstrzyknieciami zelaza, praktykowane przez niektorych sportowcow, moze modyfikowac uzyskiwane wyniki. Obniza to poziom rozpuszczalnych receptorow transferyny, jednego z waznych testow potwierdzajaxych stosowanie rHuEPO. Dlatego zaleca się azeby u zawodnikow z wysokimi poziomami ferrytyny przeprowadzac testy dwukrotnie (przed i po sezonie zawodow) w celu wykluczenia mozliwosci wahan indywidualnych (we-wnatrz osobnicznych).
Inna, metodą maskowania efektow stosowania preparatow rHuEPO jest zwiekszenie objetosci osocza krwi z jednoczesnym rozrzedzeniem jej skladnikow, co powoduje obnizenie poziomow m.in. hemoglobiny, hematokrytu i innych markerow.
Najczesciej stosowane sa wstrzyknicia dozylne preparatu skrobi hydroksyetanolowej (hydroxyethyl starch - HES). Podczas Mistrzostw Swiata (Lahti, luty 2001 r.) stwierdzono, ze niektorzy norwescy narciarze stosowali ten preparat. Metoda GC/MS pozwala najednoznaczne stwierdzenie obecnosci metabolitow HES w moczu, a tym samym udowodnienie stosowania dopingu. Warto przy tym zaznaczyc, ze preparat HES moze być przyczyna ostrej niewydolnosci nerek. Od stycznia 2000 roku stosowanie substancji, zwiekszajacych objetosc osocza, zostalo zakazane weszly na liste metod dopingu .
Wykorzystywanie substytutow krwi, jak tez sztucznych przenosnikow tlenu, m.in. roztworow modyfikowanej hemoglobiny (krwi bydlecej, pozbawionej skladnikow komorkowych - HBOC-201) lub emulsji tetrafluorowegla (perfluorocarbon-PFC) jest rowniez zakazane, a ich wykrycie jest stosunkowo proste.


Wspolczesne metody wykrywania dopingu hormonem wzrostu (hGH)


Podobne jak w przypadku EPO w procedurach, wykrywających stosowanie preparatów hormonu wzrostu, wyróżnia się dwie metody :

1) bezposrednia, - immunologiczna pozwalajaca na odroznienie izomerow pochodzenia przysadkowego,naturalnie wytwarzanego hGH, od monomeru rekombinowanego egzogennego
hormonu wzrostu rhGH;

2) posrednie - oznaczajace poziom markerow surowicy krwi, ktore świadczą o dluzej utrzymujacych się efektach dzialania tego hormonu .
Obie metody wymagaja pobierania probek krwi.
W przypadku pierwszej metody tzw. ,,okno wykrycia" wynosi 24 godziny od wstrzyknięcia preparatu rhGH, a ponadto wysilek fizyczny ma wplyw na wynik badania, dlatego powinno być ono przeprowadzane rano przed treningiem i zawodami .
Podwyzszone wyniki markerow dzialania rhGH utrzymuja sie. przez okres okolo 2 tygodni i sa_ wyzsze u mezczyzn niz u kobiet. Na wyniki tych testow nie ma wpływu nawet bardzo intensywny wysilek fizyczny. Dlatego moga. byc przeprowadzane u zawodnika zaraz po zakonczeniu zawodow sportowych .
Podstawa interpretacji wynikow testu bezposredniego jest stwierdzenie, ze przysadkowy hormon wzrostu w surowicy zawiera rozne molekularne izofomy: 22-kDa-GH i 20 kDa-GH. Izomer 20 kDa, normalnie znajdujacy się w surowicy, stanowi 10% izomeru 22 kDa-GH. Brak izomeru 20 kDa-GH, a obecnosc wylacznie 22 kDa-GH, swiadczy o podaniu rhGH. Badanie nie pozwala na wykrycie, czy podane zostaly preparaty naturalnego przysadkowego hormonu lub hormonu uwalniajacego hormon wzrostu (GHRH) .
Podstawa badan posrednich dopingu z uzyciem rhGH sa zmiany okreslonych parametrow regulowanych przez naturalny hormon. Wykrycie stosowania rhGH jest mozliwe, gdy stwierdza się wzrost poziomu (powyzej normy) GH-zaleznych markerow. Do markerow AGH naleza 4 markery pochodzenia wajcobowego: IGF-1 (insulinopodobny czynnik wzrostu); bialko 2 - wiazace IFG-1 (IGF-2BG); bialko 3-wiazace IGF1 (IGF-3BG); ALS (acid labile sub-unit) oraz 4 markery pochodzenia kostnego: osteokalcina, prokolagen typ III (P-III-P), telepeptyd kolagenu I i propeptyd c-koncowego kolagenu typ I . Dokladne badania, przeprowadzone na 100 ochotnikach przed, w czasie i w 3 miesiace od zaprzestania podawania rhGH, wykazaly, ze dla odroznienia grup, otrzymujacych rhGH i placebo, wystarczy oznaczenie dwoch markerow IGF-1 i prokolagenu typ III (P-III-P). Badania wykazaly tez bardzo dobra stabilnosc i powtarzalnosc oznaczen ww. markerow podczas ich przechowywania .
Czulosc diagnostyczna powyzszych testow, swiadczacych o stosowaniu dopingu z uzyciem rhGH, ocenia się na ponad 90%, z prawdopodobienstwem mniejszym niz 1:10 000, ze tego dopingu nie stosowano. Nalezy podkreslic, ze analiza dyskryminacyjna wynikow przeprowadzonych testow wypada znacznie gorzej u kobiet niz u mezczyzn - czulosc diagnostyczna tych testow jest u nich znacznie nizsza .
Reasumujac, nalezy podkreslic, ze postep techniczny, instrumentalny i analityczny, poparty osiagnieciami nauk podstawowych (farmakologii, fizjologii i patologii) i klinicznych, pozwala na coraz szybsze, dokladniejsze i niezawodne wykrywanie oraz identyfikacje: srodkow i metod dopingu w sporcie. Coraz mniej pozostaje ,,bialych plam", czyli tzw. ,,niewykrywalnych" srodkow w programach antydopingowych, z powodu braku wlasciwych metod, za pomoca ktorych mozna jednoznacznie dowiesc stosowania dopingu.